本研究以4個不同感官特性牧場的牛奶為研究對象,采用CATA法、GC-MS以及GC-MS-O聯用技術研究了牛奶的感官特征和揮發性風味物質。采用單因素方差分析、對應分析(CA)和偏最小二乘回歸(PLSR)等方法,分析影響不同牧場牛奶感官差異的香氣活性化合物,以期為實際乳品工業中的牛奶感官品質的控制提供進一步的理論參考。
一、材料與方法
01 材料與試劑
從河北的6個牧場獲取6份牛奶樣品,通過初步感官評價(數據未顯示)篩選出4種感官差異較大的牛奶樣品,分別標記為一牧、二牧、三牧、四牧(表1)。

利用SPME-Arrow萃取頭進行風味化合物的萃取,并對提取工藝參數進行優化。經優化后的條件:10g樣品置于40mL的頂空瓶中,向其中加入1g氯化鈉提高萃取效率,并向其中添加1μL質量濃度為0.816mg/mL的2-甲基-3-庚酮作為內標。在45℃水浴鍋中平衡20min后,利用SPME-Arrow的萃取頭吸附30min,在GC-MS中解吸5min。
03 GC-MS條件
色譜條件:DB-WAX型毛細管柱(60m×0.25mm,0.25?μm),以氦氣作為載氣,設置恒定流速1.2mL/min。升溫程序:起始柱溫為40℃,以4℃/min升溫到230℃,維持2min。采用不分流模式。
質譜條件:電子電離(electronionization,EI)源,電子能量70eV;進樣口溫度250℃,離子源溫度230℃,四極桿溫度150℃;全掃描模式,質量掃描范圍m/z35~350。
04 GC-MS-O條件
采用配備嗅覺檢測端口的GC-MS。高純氮氣(99.99%)作為GC-O分析的載氣。嗅聞口與質譜儀進樣分流比1∶1,嗅聞口和傳輸線的溫度分別保持在230℃和250℃,在檢測口通入濕潤的空氣。其他條件同1.3節GC-MS條件。由4名有牛奶感官經驗的小組成員進行,針對牛奶香氣物質對評價員進行額外12h培訓(每周3h,共4周)。嗅聞時,實時記錄香氣化合物出現的時間、氣味特征以及氣味強度(aromaintensity,AI)。參考文獻方法并進行調整,將AI分5個等級,分別以0、1、2、3、4分的形式表示香氣強度,“0”表示未識別到任何氣味,“1”表示可以準確識別氣味但持續時間短,“2”表示能快速識別氣味且持續時間長,“3”表示能準確快速識別氣味且持續時間較長,“4”表示能準確快速識別氣味且持續時間更長。如果2個及其以上的小組成員感知到氣味,就確定一個香氣活性物質。
05 定性定量分析
采用NIST14譜庫、計算化合物的保留指數(retentionindex,RI)與文獻中的保留指數進行對比以及比對嗅聞結果對牛奶中化合物進行定性分析。RI計算:將正構烷烴C7~C30與牛奶在相同的色譜條件下得出GC保留時間,根據公式計算待測物i的RI(tn<ti<tn+1):

定量分析:內標半定量法,根據化合物及內標化合物峰面積比值計算各揮發性組分的濃度。對嗅聞得到的香氣活性物質進行內標標準曲線法(內標為2-甲基-3-庚酮)精確定量。
06 感官評價
從北京工商大學學生中招募到50名未經培訓的消費者(18名男性和32名女性,年齡19~25歲)完成CATA問卷(圖1)。實驗開始前,每個參與者都簽署了一份知情同意書,參與者均具有長期飲用牛奶的習慣(每周至少5次)。并對招募的消費者評價員進行實驗所需的流程介紹以及感官評價等基本知識培訓。

將4份15mL的牛奶樣品置于30mL的品評杯中。樣本隨機3位數編碼呈送給參與者。期間還提供了無鹽餅干和瓶裝凈水清潔口腔。
07 數據處理
采用單因素方差分析比較GC-MS測得的揮發性風味物質的半定量及精確定量結果,并采用Tukey事后比較法進行統計學分析(以P<0.05表示差異顯著)。CATA數據以感官屬性的頻率表示,通過具有顯著差異的氣味描述詞進行CA,將氣味屬性的頻率和4個牛奶樣本之間的相關性可視化。使用PLSR,以探索CATA氣味感官屬性(頻率)與香氣活性物質之間的關系。利用IBMSPSSStatistics23、SIMCA14及Origin2018等軟件進行數據處理及圖像繪制。
二、結果與分析
01 牛奶樣品的感官分析
50名參與者通過CATA問卷對牛奶樣品的感官屬性進行勾選,表2顯示了4個牛奶樣本的22個感官屬性描述詞的使用頻次,包括10個氣味、4個滋味、4個口感和4個外觀。其中描述氣味的奶香味、奶油味,描述滋味的甜味,描述口感的醇厚以及描述外觀的流動性好為參與者勾選最多的描述詞,而氣味描述詞紙板味,滋味描述詞回味-澀味、口感描述詞顆粒感和外觀描述詞流動性差則是勾選頻率最低的。由表3可知,4個牧場牛奶樣品喜好度評分均存在顯著差異(P<0.05)。以上表明參與者傾向于使用奶香味、奶油味、甜味變量描述牛奶樣品的風味,它們是牛奶中普遍存在的風味屬性,也是消費者所喜愛的風味屬性。


采用HS-SPME-Arrow-GC-MS初步分析造成4個牧場牛奶樣品感官差異的揮發性風味物質,圖3A清楚地顯示了4個牧場牛奶樣品的揮發性風味物質數量,共鑒定出37種揮發性物質,包括酸類11種、酮類3種、醇類11種、醛類6種、酯類2種以及萜烯類2種、含硫化合物1種和酚類物質1種。一牧和二牧的風味物質比三牧和四牧多,4個樣品被檢測出17種相同的成分。將4個樣品中風味物質的種類通過含量進行比較,如圖3B所示。可以看出,一牧牛奶樣品風味物質釋放含量明顯高于其他3個牧場,三牧和四牧樣本間的差異相對較小。其中一牧的酸類和酮類物質含量最高,牛奶中的酸類物質來源于脂肪分解、乳糖和氨基酸的降解,而牛奶中的揮發性脂肪酸一般是指含偶數碳的中短鏈脂肪酸,如丁酸、己酸、辛酸等。此外,酸類除了能夠作為揮發性物質外,還是酮類化合物的前體物質,酮類主要由熱加工過程中的脂肪降解和游離脂肪酸經氧化為β-酮酸后脫羧反應產生。二牧中的醛類化合物含量在4個樣品中最高,牛奶中的醛類化合物主要來源于脂肪酸代謝、氨基酸轉氨作用或Strecker降解。醇類和酯類在所有樣品中均較少,牛奶中的醇類物質可能來源于化學降解,也可能是由于微生物的活動產生的,醇類的風味閾值較醛類高,因此對風味的影響較醛類物質低。
為更直觀地分辨4個牛奶樣品間的差異,基于其風味物質的定性定量結果,對樣品進行主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)(圖3C),PC1和PC2分別解釋了55.6%和29.3%的方差,兩個PC總方差貢獻大于80%,可以基本反映樣品整體信息。不同樣品在PC1上有較大差異。三牧和四牧在PC1上投影較近,揮發性風味物質較為相似,一牧、二牧則與上述兩個樣品相距較遠,表明揮發性風味物質差別較大。與一牧相關的揮發性物質最多,均存在PC1的負軸上,如中短鏈脂肪酸、2-庚酮、壬醛等。而二牧與3-己醇、辛醇、糠醛、苯乙烯、苯甲酸等物質距離較近。三牧和四牧與2-戊醇、檸檬烯、己醛、苯乙酮等揮發性物質聚集在一起。其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、己醛、檸檬烯、苯乙烯在韓兆盛等的研究中也有發現,因此,這可能是造成牛奶感官差異的風味物質。

基于GC-MS從牛奶樣品中共鑒定出37種揮發性風味物質,為進一步確定引起4個牧場牛奶樣品感官差異的主要香氣活性物質,本研究進一步采用GC-MS-O技術從中分析出AI≥1的14種氣味活性物質,并通過標準曲線計算這些香氣活性物質在牛奶中的精確含量(表4),其中包括酸類7種(乙酸、丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二酸)、酮類2種(2-庚酮和苯乙酮)、醛類2種(己醛和癸醛)、醇類1種(1-辛烯-3-醇)以及萜烯類2種(檸檬烯和苯乙烯)。


基于PLSR的模型分析氣味CATA變量(Y變量)與香氣活性物質(X變量)之間的相關性。PLSR結果如圖5所示。僅使用樣本間差異顯著的氣味CATA變量進入模型。雙組分R2X(cum)值在0.630~0.807之間,R2Y(cum)值在0.788~0.968之間。PLSR模型中的Q2值用于揭示氣味屬性(Y變量)和化合物(X變量)之間的相關性。結果顯示:一牧奶香味和奶油味較為明顯,這是令人愉悅的氣味特征,與短鏈脂肪酸類化合物,如丁酸、己酸、辛酸、癸酸以及2-庚酮等相關性較大,艾娜絲等在分析全脂巴氏乳揮發性成分中得到了相似的結果;二牧具有香甜味,與檸檬烯相關性較大,也是令人愉悅的氣味;三牧具有塑料味、奶腥味、金屬味的氣味特性,其中金屬味與1-辛烯-3-醇相關性較大,與潘明慧等的研究結果一致。四牧的蒸煮味較強,與苯乙烯、己醛的相關性較大,在Hedegaard等對3種不同脂肪酸組分的牛奶的研究中同樣也發現蒸煮味與己醛高度相關。此外,三牧和四牧喜好度評分較低,己醛、苯乙烯、1-辛烯-3-醇與其有較大的相關性,這些物質可能是令人不愉快的氣味來源。

參考文獻:韓顥穎,王亞東,韓兆盛,王蓓,付翠霞,趙爽,喬琳雅,姚歡. 基于CATA和GC-MS-O的不同牧場牛奶感官特性及香氣活性物質分析[J]. 食品科學, 2024, 45(1): 143-149.